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小A：每次都要纠结于各种限制性内切酶的选择。

小B：操作步骤繁琐，耗时长，至少需三四天才能完成。

小C：每次只能克隆1个目的片段。

小D：片段结合位置上有时会留下“疤痕”。

忘记苦难，今天小编给大家介绍一种新的克隆方法 —— 一步法同源重组技术，带你们脱离苦海！

一步法同源重组技术是一种利用同源序列重组的原理，进行无缝克隆的技术。该技术无需考虑酶切位点，几乎适用于任何载体与任何片段的定向克隆。操作过程简单快速，只需50℃，20min即可完成反应。劲爆的是，多个片段也可以同时一次完成克隆哦！

激动宝宝小C：如此厉害，是如何做到呢？

【秘】一步法同源重组技术的关键在于同源重组酶。它兼具外切酶活性、DNA聚合酶活性及连接酶活性。

外切酶活性：该酶活性能特异性地识别载体和插入片段末端的15-20bp的同源序列，并沿着5'至3'方向，切割双链DNA，从而产生粘性末端，粘性末端的碱基在50℃作用下进行互补配对，将具备同源序列的载体与插入片段“融合”。

DNA聚合酶活性：外切酶作用后，并不能保证将片段和载体的5'末端都降解成一样长的粘性末端，同源末端退火配对后，还存在单链的碱基缺口。此时需要借助DNA聚合酶活性进行修复。

连接酶活性：催化形成磷酸二酯键，将所有缺口缝合，实现无“疤痕”拼接，即无缝克隆。

好奇宝宝小D：外切酶降解双链DNA多长呢？是否会把双链DNA切割成单链导致无法进行片段重组呢？

莫担心，一步法同源重组自有妙招！一步法同源重组的重组反应温度是50℃，远高于外切酶的最适温度。此外，外切酶的含量较低，故重组反应体系中很快会失去外切酶活性。对于200bp以上的双链DNA片段都是完全不用担心的。

心急宝宝小B：这么牛逼的一步法同源重组，快给我们讲讲怎么操作吧。

1.制备载体

需将线性化载体制备好，既可以选择酶切，也可以选择PCR的方式制备线性化载体。

2.设计目的片段引物

在目的片段上下游引物的5'端引入15-25bp左右载体末端同源序列。

3.扩增目的片段

通过PCR的方法，使目的片段的两端加上了与载体末端相应的同源序列.

4.重组反应

按比例混合线性化载体和目的片段，50℃反应20 min。

5.转化，鉴定

将重组产物直接转化后涂平板，挑取克隆进行阳性鉴定。

机智宝宝小A：一步法同源重组有啥应用呢？

一步法同源重组可以应用于定点突变，CRISPR，构建多顺反子表达载体等等。